羟基喜树碱半固体脂质纳米粒的体外药剂学性质研究

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[摘要] 目的:制备羟基喜树碱的半固体脂质纳米粒(HCPT-SSLN)。方法:在单因素考察的基础上,通过正交设计优选处方和制备工艺,并对优化条件下制备的HCPT-SSLN进行质量评价。结果:制备的HCPT- SSLN平均粒径为130. 5 nm,多分散系数为0. 18,载药量为2. 51%,包封率为79. 19%, Zeta电位为-33. 1 mV;体外释药规律符合Weibull方程lnln[1/(1-Q)]=0. 263 3lnt+0. 050 9(r=0. 948 5);HCPT-SSLN 4℃ 下放置6个月,纳米粒外观、粒径及包封率无明显变化。结论:所制备的HCPT-SSLN包封率和载药量较高, 粒径分布均匀,稳定性良好,体外释药具有缓释特点,为羟基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。
   [关键词] 羟基喜树碱;半固体脂质纳米粒;正交设计;体外释药   
   纳米粒载药系统自1976年由Birrenbach首次报道以来,由于其具有可生物降解、低免疫性、有一定靶向性且制剂形式多样化等优点,至今已取得很大拓展[1]。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparti- cles, SLN)是粒径为50~1 000 nm的新一代亚微粒给药系统[2],它能将药物包裹于类脂核中而使药物稳定性增加,并具有缓控释、靶向、低毒等优点。羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)是拓扑异构酶Ⅰ(TOPO-Ⅰ)抑制剂[3]。它抗瘤谱广,且无交叉耐药性,目前已作为临床一线用药。但其特殊的理化性质:水不溶脂难溶、内酯环结构不稳定等因素,使得目前临床应用受到了限制[4]。本探讨在单因素考察的基础上,通过正交设计优选处方和制备工艺,以固体脂质和液体脂质混合物为载体材料制备HCPT的半固体脂质纳米粒(hydroxy- camptothecin semisolid lipid nanoparticles, HCPT- SSLN),并对优化条件下制备的HCPT-SSLN进行了质量评价。紫外分光光度计(英国Thermo Spectronic公司);激光粒度仪3000HS(英国Malv- ern InstrumentsLtd);冷冻干燥机(LABCONCO Free- Zone 12L); JEM 2010透射电子显微镜(TEM,日本电子株式会社);TMP-1型电子天平(德国Sartorius 公司);RCD 6型药物溶出仪(上海黄海仪器厂); Waters996高效液相色谱仪(515泵、996 UV检测仪、7725进样器,美国Waters公司);透析袋(美国进口,上海分装,截留分子量3500)。 10-羟基喜树碱原料药(HPLC检测含量98%, 四川广汉市生化制品有限公司,批号: 050411); Pal- mitic acid(十六酸,汕头市西陇化工厂); Dynasan 118(三硬脂酸甘油酯, Sasol); Corn oil(玉米油, Sig- ma);注射用大豆卵磷脂(上海太伟药业有限公司); SolutolHS 15(聚乙二醇15羟基硬脂酸醋, BASF); CremophorEL(氢化蓖麻油, BASF); PEG-8-辛酸癸酸甘油酯(GATTEFOSSE);辛酸/癸酸三甘油酯(浙江兰溪物美化工有限公司);泊洛沙姆188(Sigma); 卖泽(Myrj)59、苄泽(Brij)53(Sigma),其他试剂均为分析纯;双蒸水用前经0. 45μm微孔滤膜过滤。
   方  法 1 HCPT-SSLN的制备采用乳化蒸发-冷却固化法制备HCPT-SSLN。称取一定量的HCPT、脂质、卵磷脂共溶于适量有机溶剂中制得有机相,另称取适量表面活性剂溶于水中制得水相,在75℃水浴下,将有机相匀速注入水相中,避光恒温搅拌,挥干有机溶剂并浓缩至一定体积,将此半透明乳液快速分散于适量0℃冰水中继续搅拌固化0.5 h,经0.8μm微孔滤膜过滤,即得HCPT-SSLN。以纳米粒的外观、粒径、包封率为考察指标,分别考察了有机溶剂种类、有机相种类、表面活性剂种类、固态脂质/液态脂质物质的量比、药脂比、有机溶剂用量、表面活性剂浓度、水相与油相中表面活性剂比例、乳化过程中水相与油相比例、有机相注入水相速度、乳化蒸发搅拌时间、搅拌速度等单因素的影响。 2 正交设计优化HCPT-SSLN的制备工艺在单因素实验考察的基础上,选择药脂比(A)、固态脂质与液态脂质的物质的量比(B)、表面活性剂浓度(C)3个因素,每个因素选择3个水平,按正交设计表L9(34)试验。以包封率为指标,按正交结果拟定的最佳处方和工艺制备3批样品,对制得的 HCPT-SSLN进行质量评价来对优化结果进行验证。 3 HCPT-SSLN冻干粉的制备按2mL/瓶将HCPT-SSLN分装在7mL的西林瓶中,每瓶中加入4. 0%的乳糖,搅拌使完全溶解, 放入冷冻干燥机,按照0. 5℃·min-1降温至-34℃ 并维持24 h,在冷凝器低温、干燥箱保持一定真空度条件下,按照0. 07, 0. 04, 0. 07℃·min-13阶段升温至25℃,保温10 h,取出样品,压盖处理,即得 HCPT-SSLN冻干粉剂。 4 HCPT-SSLN的质量评价 4. 1 形态、粒径分布和Zeta电位测定取HCPT-SSLN适量,稀释,滴加在覆盖碳膜的铜网上,室温(25℃)下以2. 0%的磷钨酸钠液负染,透射电镜下观察粒径大小和形态。取HCPT-SSLN适量,稀释,波长633 nm处 Malvern激光粒度仪上测定其粒径和Zeta电位。 4. 2 HCPT的含量测定精密称定1. 0mgHCPT置50mL量瓶中,用pH 12.0 NaOH溶液(0. 01mol·L-1)配制浓度为20μg· mL-1的溶液作为贮备液。紫外扫描结果表明其最大吸收波长为414 nm,且所有辅料在该波长处的紫外吸收对测定结果无干扰。另取贮备液分别配制浓度为0. 2, 1. 0, 2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10. 0μg·mL-1的溶液,以其在414 nm处的吸收度(A)为纵坐标,浓度(C,μg·mL-1)为横坐标,得标准曲线方程:A= 0·067 8C+0.001 3(r=0. 999 9),表明HCPT在 0. 2~10. 0μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。样品处理方法:取1. 0 mL HCPT-SSLN用pH 5·0 PBS液稀释定容至25. 0mL,取其中1. 0mL于试管中,加入一定量的氯仿和pH 12. 0 NaOH溶液, 涡旋混匀离心,取上清液于414 nm处测定吸收度。另取pH 5. 0 PBS液1. 0mL,同法操作得空白对照。回收率测定:取HCPT贮备液配制浓度为0. 4, 4. 0, 8. 0μg·mL-1的溶液,各取1. 0mL,用pH 12. 0 NaOH溶液稀释到5. 0mL。另取1. 0mL空白纳米溶液,用pH 5. 0 PBS液稀释定容至25. 0 mL。取 1·0mL分别加入上述3种浓度的溶液中,按“HCPT 的含量测定”项方法处理后测定,各浓度组重复3次。 4. 3 包封率的测定包封率(EE)指被包封于纳米粒中的药物含量与投药总量的比值。精密吸取1. 0mLHCPT-SSLN 上样于SephadexG-50柱,以pH 5. 0 PBS液洗脱,洗脱速度为1mL·min-1,收集乳白色流分,取1. 0mL 按“HCPT的含量测定”项下方法处理,测定包封在脂质体内的HCPT浓度C1;另取1. 0 mL HCPT- SSLN,加pH 5. 0 PBS液稀释到25. 0mL,同法测定脂质体制剂中的HCPT浓度C2,包封率(EE) /% = C1/C2×100。 4. 4 载药量的测定载药量(Drug Loading Coefficien,t DL)系指纳米粒中所含药物量占制剂总量的百分率。即:DL/% = 投药量×EE /HCPT-SSLN冻干粉总量×100。 4. 5 稳定性考察取适量HCPT-SSLN分别置于室温(25℃)和 4℃条件下放置6个月,考察其稳定性。观察项目为外观、形态、粒径及包封率。 5 HCPT-SSLN的体外释药 5. 1 色谱条件色谱柱为LiChroCART-C18柱(250mm×4mm, 5 μm);流动相为乙腈-0. 075 mol·L-1醋酸铵缓冲液 (30∶70)(调pH 6.4,含5mmol·L-1三乙胺);流速为 1.0mL·min-1;进样量为20μL;柱温为(30±2)℃; 紫外检测器检测波长为384 nm。 5. 2 体外释药方法取一定量的HCPT-SSLN转入已处理过的透析袋中,扎紧,悬置于盛有1 000 mL pH 7. 4 PBS(含 30%甲醇)的溶出瓶中,避光恒温[(37±1)℃]恒速(100 r·min-1)搅拌,定时取样1. 0mL,同时补加等体积同温度的释药介质。将所取样品加入200 μL稀乙酸,涡旋混匀,室温避光,放置24 h,过滤后取20μL进样,计算累积释药量,同时取等量的药物装于透析袋内作为对照。 5. 3 体外释药介质中HCPT浓度的测定精密称取干燥至恒重的HCPT对照品5. 0mg, 用乙腈溶解并定容至100mL量瓶中即得HCPT标准液,精密移取10, 30, 50, 100, 200, 400, 1 000μL标准液于10mL量瓶中并用乙腈定容,进样20μL,以峰面积A对浓度C进行线性回归。 5. 4 回收率测定精密移取HCPT标准液适量,用混合溶剂(甲醇-冰醋酸-pH 7. 4 PBS=3∶2∶7)稀释至0. 5mL,混匀,配成0. 125, 1. 25, 2. 5μg·mL-1的3种浓度溶液,每个浓度6份,按“5.3”项下方法测定。将色谱图峰面积代入回归方程,计算得HCPT的测定浓度, 以测定浓度与配置浓度之比计算回收率。 5. 5 精密度考察精密移取HCPT标准液适量,配成0. 05, 0. 5, 5·0μg·mL-1的3种浓度溶液,按“5.3”项下方法测定,日内测定6次,日间连续测定6 d,每天测定3 次,计算日内和日间精密度。 6 统计学处理数据采用SPSS 12. 0软件处理, (-x±s)表示,方差分析采用完全随机设计的单因素方差分析(one- wayANOVA),P<0. 05时有统计学意义。结  果 1 单因素考察在文献调查及单因素考察的基础上筛选出来的基本处方组成为:HCPT、十六酸、三硬脂酸甘油酯、玉米油、大豆卵磷脂、SolutolHS 15、丙酮和乙醇。另由考察确定以下参数:表面活性剂为Solutol HS 15-Soya lecithin=1∶1,有机相溶剂采用12mL丙酮∶6mL乙醇,水相与油相比为1. 5/1,有机相注入水相选定2. 0 mL·min-1的滴速,搅拌速度为800 r·min-1,乳化蒸发搅拌时间为2 h。此外,选择固态脂质与液态脂质的物质的量比、药脂比和表面活性剂浓度3个因素进一步考察优化。 2 正交设计实验因素和水平见表1,正交设计表及结果见表2, 方差分析结果见表3。表1 因素和水平水平因  素 HCPT /脂质(A) 固态脂质 /液态脂质(B) 表面活性剂浓度(C) /% 1 1∶20 1∶1 3. 0 2 1∶25 2∶1 4. 0 3 1∶30 3∶1 5. 0 表2 正交设计结果编号A B C D EE/% 1 1 1 1 1 52. 9 2 1 2 2 2 70. 2 3 1 3 3 3 83. 6 4 2 1 2 3 52. 0 5 2 2 3 1 85. 7 6 2 3 1 2 51. 0 7 3 1 3 2 74. 1 8 3 2 1 3 55. 2 9 3 3 2 1 69. 0 R 18. 0 32. 1 84. 3 16. 表3 方差分析结果因素自由度平均方差F F临界值 A 2 27. 04 1. 07 B 2 93. 99 3. 73 F0. 05(2, 2)=19. 00 C 2 603. 43 23. 94aF0. 01(2, 2)=99. 01 D(误差) 2 25. 21   a:P<0. 05,该因素对包封率的影响具有显著性意义由表2可见,各个因素不同水平对SSLN包封率的影响由大到小依次为:A1>A3>A2, B2>B3> B1,C3>C2>C1;R为极差值,RC>RB>RA,即表面活性剂浓度对SSLN的包封率影响最大,其次是固态脂质与液态脂质的物质的量比,再次是药脂比;故我们选取A1B2C3为最佳处方条件,即药脂比为 1∶20,固态脂质与液态脂质的物质的量比为2∶1,表面活性剂浓度为5%。由表3可见只有表面活性剂浓度对包封率的影响有统计学意义,其次为固态脂质与液态脂质的物质的量比、再次是药脂比。 3 HCPT-SSLN的质量评价 3. 1 形态、粒径分布测定所制备的HCPT-SSLN为均一、稳定的半透明状分散系,体系略带淡蓝色乳光。激光散射法测定3 批样品的平均粒径为(130. 5±14. 41) nm,多分散系数为0.18,说明粒径分布均匀;透射电镜观察结果表明,纳米粒为圆整的球状体,无明显团聚现象。对电镜所拍摄的粒径数据(N=502)采用SAS软件进行正态统计分析,结果粒径呈非正态分布,见图1。图1 HCPT-SSLN的TEM图 (原放大倍数:×50 000) 3. 2 Zeta电位测定 Zeta电位与纳米粒体系的稳定性密切相关。测定Zeta电位可以预测纳米粒的储藏稳定性。3批纳米粒Zeta电位平均为(-33. 1±3. 30) mV,结果见表4。 3. 3 包封率、载药量和回收率预实验表明PBS液(pH 5. 0)能完全洗脱脂质体,但对游离HCPT无洗脱能力,故该方法可靠。测得包封率为(79. 19±2. 78)%,RSD为3. 51%,载药量为(2. 51±0. 17)%, RSD为6. 69%,详见表4。平均回收率为(100. 31±1. 14)%,RSD为1. 14%。表4 HCPT-SSLN的粒径、Zeta电位、包封率和载药量的测定结果n=3 样品粒径/nm Zeta电位/mV包封率/%载药量/% 1 125. 7±8. 82 -30. 2±2. 49 79. 82±2. 50 2. 46±0. 14 2 147. 0±5. 96 -36. 1±1. 56 77. 29±1. 57 2. 56±0. 21 3 118. 7±7. 98 -33. 0±2. 87 80. 47±3. 71 2. 51±0. 15 3. 4 pH值 3批样品pH值分别为6. 26, 6. 29, 6. 31,平均为(6. 29±0. 023),RSD为0. 366%。 3. 5 冻干粉的水分散性及粒径分析冻干粉样品呈现白色疏松块状,注射用水及生理氯化钠溶液中分散性良好。另取少许粉末,同方法中“4.1”项下操作, Malvern测得平均粒径为 (138. 9±15. 28) nm。 3. 6 稳定性考察 HCPT-SSLN于室温(25℃)避光放置6个月后, 出现了霉菌、絮状或胶状沉淀,黄色药物结晶析出等现象。4℃条件下避光放置6个月后,无沉淀及药物结晶析出,为均一、稳定的半透明状分散系,且测得平均粒径为(141. 8±7. 84) nm,包封率为(77. 29± 1·63)%,表明在4℃条件下该制剂的稳定性要比常温下好。 3. 7 体外释药性质考察 3.7.1 色谱行为 HCPT在4. 0min出峰,理论塔板数>2 500。 3.7.2 线性关系 回归方程为A=78.217C-495.99, r=0.9999(n=6)。线性范围为50~5000 ng·mL-1。 3.7.3 方法回收率 低、中、高3个浓度的回收率分别为101. 70%, 99. 40%, 98. 70%,平均回收率为 99. 93%,RSD为3. 27% (n=6)。 3.7.4 精密度考察 日内相对标准差为2. 31%, 日间相对标准差为2. 72%。 3.7.5 体外释药曲线由图2可见, 0 ~3 h内 HCPT-SSLN释药19. 6%,而等量的游离药物只释放 3. 3%,有一定程度的突释;此外, 3~72 h为HCPT SSLN的相对慢速释放相, 72 h时累积释药量不超过 70%;而对照药物72 h累积释药量只有24. 7%,这可能与HCPT的水饱和溶解度只有0. 81μg·mL-1 有关,可见将HCPT用脂质材料包裹制成纳米粒后在相同时间内更有利于药物的释放。图2 载药纳米粒和溶液剂中的HCPT的体外释放曲线 3.7.6 药物释放速率的探讨 分别以一级动力学方程、Higuchi方程、Niebergull平方根定律、Hixson- Crowell立方根定律和Weibull方程对HCPT-SSLN 体外释药曲线进行拟合,结果表明,体外释药规律符合Weibull方程lnln[1/(1 -Q)] =0. 263 3lnt+ 0·050 9(r=0. 948 5)。讨  论 HCPT的溶解性较差,在正辛醇中的表观溶解度是其在蒸馏水中的27. 2倍,HCPT还能插入磷脂酰基链中,有一定亲和力[5]。其常见临床用量为 5~15mg·d-1,故以大量脂质来包封少量HCPT是可行的。SLN的制备方法很多,因为HCPT不溶于水,与磷脂有一定的亲和力,当HCPT溶于有机溶媒后与水溶液接触时,HCPT即大量析出。鉴于此性质,采用乳化蒸发法较好,推测制备原理是使HCPT 在高速搅拌过程中进入熔化的脂质液滴,插入磷脂双分子层中而被脂质核包封,内外水相中的游离药物有部分吸附在脂质核表面,这样制备的纳米粒有较高的包封率,但具体脂质与HCPT的作用关系还需进一步探讨。
   《中华人民共和国药典》2005年版规定羟基喜树碱钠盐注射液的含量测定方法为紫外分光光度法 (UV法)。本实验中含量测定方法的样品处理后 HCPT为开环形式,在414 nm处才有吸收峰;体外释放实验的样品处理后为闭环状态,在383 nm处有明显的吸收峰;以上2个波长在其他有关HCPT的含量测定方法探讨中均有报道。这也是HCPT本身的特点之一,且环的开闭与否对含量测定波长的选择和药效的大小有至关重要的影响。本实验采用UV 法测定HCPT在制剂中的含量,相对HPLC法操作简便,r值可达0. 999 9,回收率与包封率结果也显示此法的精密度较好。体外释放样品之所以需用HPLC 法,是因为HCPT在释放介质中的浓度甚低所致。本实验建立的高效液相测定方法的线性范围为: 50~5 000 ng·mL-1。之所以设定3个不同的浓度进行回收率测定,主要是为了考察混合溶剂(甲醇-冰醋酸-pH 7. 4 PBS=3∶2∶7)对HCPT标准液的影响,也是为了更好的说明方法的准确度。而设定 3个不同浓度进行精密度测定,也是在现行范围内取2个极值进行精密度考察,精密度考察的结果 “日内相对标准差为2. 31%,日间相对标准差为 2·72%”均为平均值,实际3个浓度由低到高的日内相对标准差分别为3. 15%, 1. 25%和2. 54%,日间相对标准差分别为2. 93%, 3. 24%和1. 98%。对优化后制备的HCPT-SSLN进行体外释放考察时发现,在体外释放过程中表现出2个释放相。 0~3 h内为快速释放相,约释放总药量的20%左右。这部分释放的药物,可能主要来自吸附于脂质纳米粒表面的药物分子或细小颗粒。3 h后,结合在脂质纳米粒骨架中的药物要跨越脂质双层才能进入释放介质,从而实现固体脂质纳米粒对药物的缓释作用。通过质量评价,本实验所制备的HCPT-SSLN包封率和载药量较高,粒径分布均匀,稳定性良好,为羟基喜树碱的临床应用提供了更广阔的前景。

[正文图表略.]
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