促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响

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摘要背景:内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,可参与新生血管的形成。探讨发现,促红细胞生成素对骨髓内皮祖细胞有动员作用,促进血管的新生和损伤组织修复。目的:观察不同浓度促红细胞生成素对体外培养的大鼠内皮祖细胞功能的影响。方法:提取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,利用密度梯度离心方法分离单核细胞进行培养,分别在培养基中加入0,4,8 U/mL不同浓度的促红细胞生成素进行培养。培养7 d后,对内皮祖细胞利用FITC-UEA-1和Dil-Ac-LDL共同染色方法进行鉴定;同时利用CD34和CD133共同标记,以流式细胞仪进行鉴定;采用黏附实验、迁移实验及MTT实验对其功能进行评定。结果与结论:培养到7 d左右,细胞形态变化完全,细胞之间形成联接,并可以围成似管腔状形态,十二三天时,细胞融合,形成铺路石样。培养细胞荧光染色显示内皮祖细胞呈双阳性染色,经流式细胞仪鉴定培养的内皮祖细胞可以结合CD133和CD34。黏附实验、迁移实验及MTT实验显示,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖能力。说明在0~8 U/mL浓度内,促红细胞生成素呈剂量依赖性提高内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖功能。
关键词:内皮祖细胞;促红细胞生成素;细胞培养;功能;大鼠;血管组织工程doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.15.011王东,王亮,刘庆国,王晓楠,尉辉杰,张建宁.促红细胞生成素对大鼠内皮祖细胞生物学特点的影响[J].中国组织工程探讨与临床康复,2010,14(15):2705-2708.[***www*crter*org ***cn*zglckf*com]引言自内皮祖细胞(Endothelial progenitorcells,EPCs)被Asahara等[1]从外周血分离出并证实具有分化为成熟内皮细胞和在体内能参与成体动物的新血管生成的能力后,其应用价值越来越受到人们的关注。此后,EPCs被用来进行治疗性血管新生、覆盖组织工程血管及基因治疗、生物性心肌再生等多方面的探讨[1-3]。重组人促红细胞生成素(recombinanthuman erythropoietin,rhEPO)在过去的十几年中,已被数以百万计的患者用于治疗肾性贫血。近年来,随着人们探讨的深入,EPCs的功能和作用已远远超过了其干细胞的生物学作用,其具有抗炎症、抗凋亡、促进神经元新生等作用[4-7],同时促红细胞生成素可以动员骨髓EPCs到外周血中,在血管新生中发挥重要作用[2,6]。本文通过体外培养大鼠骨髓EPCs,观察不同浓度rhEPO对于EPCs功能的影响,为EPCs的临床王东,等.应用提供实验基础。1材料和方法设计:随机对照动物实验,细胞学体外实验。时间及地点:于2008-10/2009-06在天津市神经病学探讨所完成。材料:成年雄性清洁级Wistar大鼠20只,体质量200~250 g,由解放军军事科学院提供。对动物处置方法符合科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
主要仪器与试剂:实验方法:EPCs的分离与培养:采用大鼠骨髓经过密度梯度离心的方法分离单核细胞[8-9]。Wistar大鼠采用脱颈处死后,于体积分数75%乙醇中消毒15 min后,在无菌环境下,取出其胫骨和股骨后,于超净台内,用无菌HBSS液冲出骨髓,吹打均匀后,加进提前放有淋巴细胞分离液的无菌离心管的上层,在2 000 r/min下分离20 min,吸取白膜层,于HBSS液中清洗2次,转速为15 00 r/min,各离心5 min,后悬于培养基中调成浓度为1×109L-1,加于提前包被有人纤维连接蛋白的12孔板上,在37℃,体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养,3 d后分成3组,分别加含有3种不同浓度rhEPO的培养液(0,4,8 U/mL),将不贴壁的细胞移走,后每隔3 d换一次培养基。EPCs的鉴定:取培养第1代细胞进行鉴定,培养7 d时,以FITC-UEA-1和Dil-Ac-LDL双标鉴定[1]。

[正文图表略.]
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